INTRODUÇÃO:
A produção de microrganismos no sistema On farm apresenta desafios e oportunidades (Faria et al., 2023). Um dos desafios encontrados na produção dos microrganismos neste sistema é a complexidade envolvida no processo, visto que cada espécie de microrganismo, como a bactéria Chromobacterium Subtsugae, possui parâmetros específicos de crescimento.
A C. subtsugae foi isolada em 2000 por pesquisadores do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos do solo de uma floresta em Maryland-EUA como uma nova espécie de bactéria do gênero Chromobacterium (Martin et al., 2007a). É uma espécie gram-negativa, facultativamente aeróbica, móvel, com flagelos polares, que produz a violaceína, um metabólito que confere às suas colônias uma típica coloração violeta. As primeiras colônias podem ser observadas após 2-3 dias em meio específico, com pH entre 6 e 8, incubado a 25-30 °C, podendo ser inicialmente de cor creme, tornando-se gradualmente violeta claro a escuro entre 72 e 96 horas de incubação (Martin et al., 2007b; Koivunen et al., 2009).
A bactéria C. subtsugae possui atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos como, por exemplo, o percevejo-verde da soja, Nezara viridula, (Hemiptera: Pentatomidae) e vaquinhas, Diabrotica spp. (Coleoptera: Crysomelidae) (Martin et al., 2007a, b). A atividade de amplo espectro de C. subtsugae está relacionada a múltiplos modos de ação envolvendo diferentes compostos que contribuem para sua ação inseticida (Asolkar et al., 2014).
No Brasil ainda não existem inseticidas microbiológicos comerciais registrados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) que contenham a bactéria C. subtsugae em sua composição (Agrofit, 2023). No entanto, há inúmeros relatos de produtores que apostam na multiplicação do microrganismo no interior de fazendas, no denominado sistema On farm de produção de bioinsumos, visando Ao manejo biológico de pragas agrícolas. O interesse pela produção On farm cresceu significativamente após o lançamento do Programa Nacional de Bioinsumos instituído pelo Decreto Nº 10.375, em maio de 2020, pelo MAPA.
Desta forma, em 2020, foi iniciado no Instituto Goiano de Agricultura (IGA), em Montividiu-GO, o Projeto Biofábricas, da Associação Goiana dos Produtores de Algodão (Agopa), visando à validação da multiplicação On farm de bactérias benéficas, como a C. subtsugae, no IGA e sua aplicação em diferentes propriedades produtoras de algodão.
Portanto, o objetivo deste trabalho foi validar a eficácia do processo de multiplicação On farm de C. subtsugae em Biofábrica do IGA e em propriedades parceiras do Projeto Biofábricas.
*Amostras coletadas antes do início do processo de multiplicação de C. subtsugae.
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
1. Multiplicação On farm de Chromobacterium subtsugae em Laboratório.
1.1. Etapa 1.
Nas análises realizadas antes do início da multiplicação não foi observada a presença de microrganismos no meio de cultura, mas na análise de água foi observada concentração <1,0 × 103 UFC/ml de outros microrganismos (Figura 4 A e B). O pré-inóculo apresentou concentração de 2,3 × 107 UFC/ml da bactéria C. subtsugae, com ausência de outros microrganismos (Figura 4 C). Em relação ao processo de multiplicação, na amostra T0, coletada aos 10 minutos do processo, a concentração de C. subtsugae foi 1,0 × 105 UFC/ml, e 04 horas após o início da multiplicação (T1) foi observado o mesmo exponencial de 105 UFC/ml (Figura 4 D e E). Na amostra T2, após 08 horas do processo, foi observado que C. subtsugae atingiu concentração <2,5 × 106 UFC/ml. Na avaliação realizada em 12 horas após o início do processo (T3), foi possível observar a multiplicação da bactéria C. subtsugae, que alcançou <1,1 × 108 UFC/ml (Figura 4 F e G).
Após 16 horas do início da multiplicação (T4), a C. subtsugae apresentou o maior crescimento atingindo 3,2 × 109 UFC/ml (Figura 4 H).
Assim, nesta etapa foi observado que a aeração da Biofábrica contribuiu significativamente para o sucesso da multiplicação da bactéria C. subtsugae. Nesta etapa foi detectada a presença de carga microbiana na amostra inicial de água, o que pode ter contribuído para que no T2 a concentração de outros microrganismos tenha atingido >3,0 × 108 UFC/ml. No T3 e T4, mesmo na presença de alta carga microbiana indesejada, foi possível observar a multiplicação da C. subtsugae. Nestas amostras (T3 e T4), o crescimento de outros microrganismos foi de 7,8 x 108 e 1,7 × 109 UFC/ml, respectivamente.
1.2. Etapa 2.
As análises do meio de cultura e da água não apresentaram crescimento bacteriano (microrganismos ausentes), nas amostras retiradas antes do início da multiplicação, após melhorias no processo de filtragem da água (Figura 5 A e B). O pré-inóculo (produzido no laboratório do IGA) apresentou concentração de 3,2 × 109 UFC/ml da bactéria C. subtsugae.
No entanto, na amostra deste pré-inóculo, foi observada a presença de outros microrganismos (concentração <5,0 × 107 UFC/ml) (Figura 5 C). Em relação à multiplicação, na amostra T0 (10 minutos do início do processo) a concentração da bactéria C. subtsugae foi 2,7 × 107 UFC/ml e na amostra T1 (03 horas após o início de multiplicação) foi observada a concentração 2,0 x 108 UFC/ml (Figura 5 D e E).
Nas amostras T2 e T3 (06 e 09 horas de multiplicação) a bactéria C. subtsugae atingiu concentrações de 2,6 × 108 e 7,7 × 108 UFC/ml, respectivamente (Figura 5 F e G). Nas três últimas avaliações, realizadas em 12, 16 e 24 horas do início da multiplicação (T4, T5 e T6) foi possível observar que a bactéria C. subtsugae atingiu concentrações que variaram de 6,4 × 108 a 3,9 × 109 UFC/ml (Figura 5 H, I e J). Assim, com 24 horas do início da multiplicação (T6), a C. subtsugae atingiu seu maior crescimento.
Nesta etapa, foi observado que a água filtrada e tratada contribui expressivamente para o aumento na concentração da bactéria C. subtsugae durante a multiplicação na Biofábrica. Também foram encontrados outros microrganismos na amostra T0 (5,5 × 105 UFC/ml), no início da multiplicação, e em amostras de outros tempos (T2 e T5) que podem estar relacionados, além do processo, aos microrganismos indesejáveis observados no pré-inóculo.
A concentração de outros microrganismos atingiu 6,1 × 108 UFC/ml no tempo final. No entanto, estes microrganismos não
afetaram o processo de multiplicação da bactéria C. subtsugae durante o estudo. A presença excessiva de microrganismos indesejáveis compete por nutriente e sua multiplicação pode afetar o pH do meio e interromper a multiplicação da bactéria de interesse. Nas duas etapas do estudo, o pH manteve-se na faixa de 6,6 a 7,6 que é adequada para crescimento da bactéria C. subtsugae. Por esse motivo, a presença de outros microrganismos deve ser minimizada ao máximo no início e durante o processo de multiplicação.
2. Multiplicação On farm de C. subtsugae nas fazendas do Projeto Biofábrica.
2.1. Fazenda Onça (GMS).
Na análise de água da biofábrica não foi observada presença de microrganismos “Ausente” (Figura 6 A). O préinóculo apresentou concentração de 9,6 × 107 UFC/ml da bactéria C. subtsugae, com ausência de outros microrganismos (Figura 6 B).
Em relação ao processo de multiplicação, na amostra T0, coletada aos 10 minutos do início do processo, foi detectada a presença de C. subtsugae na concentração 1,4 × 108 UFC/ml (Figura 6 C). Na amostra T1, retirada 08 horas após o início do processo, foi observado que C. subtsugae atingiu concentração 9,6 × 108 UFC/ml (Figura 6 D).
A concentração obtida neste período de tempo foi semelhante aos resultados encontrados na Etapa 2 citada anteriormente, no estudo em menor escala de biofábrica. Na amostra T2, coletada após o período de 16 horas de multiplicação, a bactéria C. subtsugae apresentou o maior crescimento, atingindo 2,0 × 109 UFC/ml (Figura 6 E).
Por fim, foi observado que a multiplicação da bactéria C. subtsugae pode ser realizada com sucesso em biofábrica de 1.500 L, desde que possua um sistema de aeração adequado. É importante frisar que nesta etapa também foi detectada a presença de microrganismos indesejados na amostra do produto multiplicado em T1 e T2, permanecendo em 108 UFC/ml. Porém, o crescimento destes microrganismos indesejados não afetou o crescimento da bactéria de interesse, que se sobressaiu durante o processo em primeiro momento.
2.2. Fazenda Cachoeirinha (JHS).
O pré-inóculo utilizado nesta etapa do estudo apresentou concentração de 3,2 × 107 UFC/ml da bactéria C. subtsugae (Figura 7 A). Também não foi encontrado nenhum outro microrganismo na amostra.
Na multiplicação da C. subtsugae, a amostra T1, coletada 08 horas após o início do processo, continha a bactéria na concentração de 8,0 × 109 UFC/ml (Figura 7 B). Na amostra T2, extraída 12 horas após do início do processo, foi encontrado C. subtsugae na concentração 1,8 × 108 UFC/ml (Figura 7 C). Neste momento, foi detectado uma pequena redução na concentração da bactéria quando comparado ao primeiro tempo de multiplicação. Na amostra T3, realizada 16 horas após o início da multiplicação, a bactéria de interesse atingiu a concentração de 1,0 × 109 UFC/ml (Figura 7 D).
Assim, após os períodos de 08 e 16 horas de multiplicação foram obtidas as maiores concentrações da bactéria C. subtsugae.
Ainda em relação ao estudo, na primeira amostra coletada (T1 – 08 horas) foi detectada a presença de microrganismos indesejados de 8,5 × 107 UFC/ml. O mesmo foi observado nas amostras T2 e T3, que apresentaram concentração de outros microrganismos na concentração de 107 UFC/ml. Essa contaminação pode estar relacionada ao processo de sanitização, ao manejo durante a manipulação dos insumos, ambiente ou ainda a água utilizada, já que não foi realizada análise prévia de pureza.
No entanto, a presença de outros microrganismos não afetou o crescimento da bactéria de interesse (Figura 7 D).
2.3. Fazenda Santa Maria do Mirante (SMM).
Na análise de água da biofábrica, não houve presença de outros microrganismos “Ausente” (Figura 8 A). O préinóculo da bactéria C. subtsugae apresentou concentração de 7,3 × 107 UFC/ml, com ausência de outros microrganismos (Figura 8 B).
Na amostra T1, retirada 16 horas após o início do processo de multiplicação, foi observado alto crescimento bacteriano, que atingiu 3,4 × 109 UFC/ml de concentração (Figura 8 C).
Nas condições instaladas foi possível observar que a amostra de água, coletada após o processo de sanitização e preenchimento da Biofábrica, não possuía contaminação, comprovando que foi realizada uma eficiente sanitização, pois a qualidade da água não foi afetada. O pré-inóculo puro, com ausência de outros microrganismos, contribui positivamente para o sucesso da multiplicação da C. subtsugae. Portanto, ao seguir toda a metodologia padrão de qualidade na multiplicação, foi possível produzir a bactéria C. subtsugae com alto crescimento (3,4 × 109 UFC/ml) após 16 horas de multiplicação na fazenda (Figura 8 C).
CONCLUSÃO:
A partir dos resultados obtidos, conclui-se que é possível produzir a bactéria C. subtsugae em alta concentração no processo de multiplicação On farm e que, nos estudos, o tempo de 16 horas do processo de multiplicação foi o mais significativo, tanto no laboratório do IGA quanto nas três biofábricas instaladas nas fazendas do Projeto Biofábricas.
Também foi possível concluir que, ao seguir corretamente os protocolos de sanitização, o número de microrganismos indesejáveis no processo pode ser reduzido e os parâmetros ideais para o crescimento de C. subtsugae, mantidos.
Mais estudos serão necessários para investigar as causas de contaminação durante a multiplicação, visto que podem ser atribuídos aos fatores que compõem o sistema, como manejo inadequado dos colaboradores, capacidade do filtro de ar e outras fontes de contaminação da água.
Fonte e trabalho completo IGA: Link do trabalho
